免疫组化非特异性染色：来源和解决方案

除了上述变量外，还有一些实验把持错误导致的非特异性染色，例如在染色过程中切片干燥。图2中，子宫切片用CD31染色，CD31标记内皮细胞。上皮细胞、子宫内膜基质细胞和腻滑肌细胞不该染色，并作为内部阴性对照。当切片在染色过程中干燥时，抗体味非特异性连系并导致大多数细胞中发生非特异性染色（图 2A）。若是在染色过程中组织没有干燥，正常染色究竟如图2B。

用于关闭非特异性连系位点的血清是把持错误的另一个起原。对于关闭，平日的做法是使用与二抗沟通物种的血清。若是使用不准确的血清进行关闭，例如来自发生一抗的物种（与二抗相反）的血清，将导致整个组织的非特异性染色。

非特异性染色的其他起原来自内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶活性、疏水、离子和静电互相感化、抗体与各类细胞上的 Fc 受体连系、内源性生物素和亲和素的非特异性连系等。

尽管内源性过氧化物酶已被描述为非特异性染色的起原，但经由将组织切片在 0.3% - 3% 过氧化氢溶液中孵育，能够很轻易地避免。确定组织切片中是否存在内源性过氧化物酶的快速方式是直接用HRP色原孵育切片（脱蜡和水化后），显色表明组织切片存在内源性活性。如图3所示，将已知富含内源性过氧化物酶的组织与显色原一路孵育。这些组织中没有染色。只有红细胞示意出一些颜色。是以，在IHC方式斥地过程中处理非特异性染色时，内源性过氧化物酶不是首要问题。

对于非特异性染色的其他原因，例如疏水互相感化、离子和静电互相感化以及一抗与Fc受体的非特异性连系，用血清、牛血清白卵白和各类其他药物关闭这一方式被普遍使用。然而，比来在一份申报中质疑IHC中关闭的需要性，该申报表明，当省略关闭时，使用46种分歧抗体在25种分歧的组织中没有发生非特异性染色。如图4解说在有或没有关闭的情形下，脾脏、肠和脑切片未显现非特异性 IHC 染色。而且在很多情形下不需要阻断内源性生物素。凭据已揭橥的文献，用血清或其他药物阻断和阻断生物素似乎不是IHC的主要步伐。是以，当视察到非特异性染色时，在解决问题时，应更多地存眷抗体和组织自己的质量。最佳做法是在方式斥地阶段搜检是否需要关闭。若是不需要，省略关闭步伐将节约时间、预算并消弭其他变量。

图4   在福尔马林固定石蜡包埋组织的免疫组化中，用血清或其他药物关闭并不主要。

小鼠脾脏（A，B），肠（C，D）和脑（E，F）的切片离别用配对的盒卵白5（PAX5），Ki67和神经胶质原纤维酸性卵白（GFAP）染色。A、C 和 E 中的切片在用 10% 正常血清关闭后染色，B、D 和 F 中的切片在与一抗孵育之前不消血清关闭染色。有或无关闭染色的切片染色究竟相似。当省略用血清关闭时，没有非特异性染色。

结论