富含MMA的“广陈皮”的抑菌机理

近日，华南理工大学食品科学与工程学院陈谷教授课题组在9月出版的《International Journal of Food Microbiology 》发表了题为“Metabolomic insights into the inhibition mechanism of methyl N-methylanthranilate: A novel quorum sensing inhibitor and antibiofilm agent against Pseudomonas aeruginosa”的研究论文，首次报道了广陈皮中N-邻甲氨基苯甲酸甲酯（MMA）对食源性病原菌铜绿假单胞菌（又称绿脓杆菌）的群体感应（QS）的抑制作用与机理。2019级博士生马永凯为该论文第一作者。

研究背景和思路

广东省江门市新会区特产陈皮，历史贸易中特称“广陈皮”，以别于其他省所产陈皮。清代大医师叶天士所开的药方“二陈汤”，特别写明“新会皮” 。因不是新会所产的其药效远逊，所以新会陈皮价格较高，皮比肉贵。区别于其他地区的陈皮，广陈皮特有邻甲氨基苯甲酸甲酯（Methyl N-methylanthranilate, MMA），虽然MMA在食品和日化产品中已有应用，但其抑菌作用与机理此前未曾被报道。基于肠道微生物群落对健康的重要影响，考察广陈皮独有的MMA的抑菌作用与机制，有助于多角度探索广陈皮优异品质的缘由。温和的群体感应抑制因子，相对于杀菌效果显著的杀菌剂，更有利于构建肠道微生态平衡，减少菌株产生抗药性的几率。

研究结论

MMA在1.25 to 6.25 mg/mL浓度下未抑制绿脓杆菌的生长，但是显著减少绿脓杆菌素分泌、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和生物膜形成，提示MMA抑制了群体感应（quorum sensing, QS）。定量RT-PCR证实了MMA抑制了一系列QS相关基因的表达，包括BHL受体、转录调节因子RhlR（rhlR）、BHL合成酶RhlI（rhlI）、弹性蛋白酶LasB（lasB）、酰基高丝氨酸内酯合酶LasR（lasR）、OdDHL受体和转录调节因子LasR（lasR）等。也抑制了生物膜合成相关基因的表达，例如几丁质酶ChiC（chiC）和膜/生物膜生物合成糖基转移酶PelF（pelF）等。

代谢组分析揭示了MMA抑制绿农杆菌群体感应的机理：

首先最大的累积代谢产物群是18种脂肪酸，以及超过200倍的TDIQ（5,6,7,8-四氢-1,3-二氧杂环[4,5-g]-异喹啉）累积。探究它们累积的缘由，基于绿脓杆菌的群体感应分子PQS（Pseudomonas Quinolone Signal, PQS, 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone）的合成是以脂肪酸和邻氨基苯甲酸盐（anthranilate）为前体，且该合成过程受邻氨基苯甲酸甲酯（methyl anthranilate，MA）的抑制；推测，MMA作为前体的类似物，与MA一样干扰了PQS的合成。大量累积的脂肪酸，尤其是C18和C20不饱和脂肪酸积累，作为膜的主要成分，必然会不可避免地增加膜的流动性和通透性，并可能增加抗生素敏感性。其次，下一组显著累积的代谢物是氨基酸，如苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和蛋氨酸。亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的累积缘由与上述推理一致，PQS的合成受阻，导致其前体邻氨基苯甲酸盐导向另外的合成通路，形成亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。然而，几种氨基酸及其衍生物显著减少，包括谷氨酸，天冬氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、甜菜碱和γ-氨基丁酸（GABA）。氨基酸的这种不平衡意味着MMA的摄入可能部分导致蛋白质合成的干扰，并使绿脓杆菌更容易受到渗透胁迫和其他非生物胁迫。第三，十几种嘌呤和嘧啶衍生物的含量发生显著不均衡的变化，会导致DNA复制和转录不可避免地受到限制。第四，参与中枢碳代谢的代谢物，如D-葡萄糖-6-磷酸（G6P）、柠檬酸和琥珀酸急剧下降，提示TCA循环效率下降，这将最终削弱细菌的毒性。此外，急剧下调的还有谷胱甘肽和构成肽聚糖细胞壁的重要成分n-乙酰胞壁酸-6磷酸。

进一步的生理实验，证实了代谢组分析所提示的MMA抑菌机理：MMA导致绿脓杆菌的细胞膜完整性受损，胞内的活性氧水平升高。

生理学和代谢组学数据表明MMA干扰绿脓杆菌的QS；但MMA是否如代谢组学分析所示干扰PQS生物合成，或是MMA与QS自诱导受体（如LasR和PqsR）竞争，仍不清楚。因此，以PqsA、LasR和PqsR为受体进行分子对接。PqsA是邻氨基苯甲酸辅酶A连接酶，是控制PQS生物合成的限速步骤。MMA比天然底物邻氨基苯甲酸盐和报道的PQS抑制剂MA具有更高的结合亲和力。与天然配体相比，对MMA具有更高结合亲和力的受体可能是MMA作用的靶点。MMA结合并干扰PQS生物合成的可能性高于其与自诱导受体进行竞争的可能性，佐证了上述代谢组分析推理出的MMA作用机制。

综上所述，MMA有效地抑制绿脓杆菌群体感应，归因于MMA干扰了群体感应因子PQS的合成关键酶，从而导致脂肪酸累积，膜通透性增加等一系列变化 最终减弱绿脓杆菌的致病性并抑制生物膜的形成。

创新性/应用前景

本研究首次揭示了MMA抑制绿脓杆菌群体感应的作用与机制，有助于开发MMA可以作为一种新型QS抑制剂和抗生物膜剂来改善食品安全，同时为解析广陈皮优异药性提供新见解，为其深入开发利用提供新思路。