FDA今日加速批准DMD疗法上市，还有这些疗法值得患者期待

▎药明康德内容团队编辑

今日， Sarepta Therapeutics公司宣布，美国FDA已经批准该公司开发的反义寡核苷酸疗法Amondys 45（casimersen）上市，用于治疗特定类型的杜氏肌营养不良症（DMD）患者。他们携带的基因突变适合使用外显子45跳跃的策略进行治疗，大约有8%的DMD患者适于这种治疗策略。这也是近3年以来，FDA加速批准的第三款基于外显子跳跃的DMD反义寡核苷酸疗法。

DMD是一种罕见的致命神经肌肉遗传病。由于编码抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的基因发生变异，导致抗肌萎缩蛋白的缺失或功能缺陷。抗肌萎缩蛋白在肌肉细胞中通过与多个结构和功能性蛋白结合形成名为DAPC的蛋白复合体。这一复合体保护肌肉细胞不会在不断收缩的过程中受到损伤。抗肌萎缩蛋白的缺失或缺陷，导致肌肉在收缩过程中出现慢性损伤以及炎症发作，最终影响肌肉的再生，导致肌肉被瘢痕组织或者脂肪代替。

DMD患者一般在3-5岁时开始发病，十几岁时失去行走能力，30~40岁时由于呼吸或心力衰竭而去世。

▲DAPC蛋白复合体示意图（图片来源：Solid Biosciences官网）

因此，针对DMD致病根源的疗法旨在恢复抗肌萎缩蛋白的表达水平。今日获批的Amondys 45就是这类疗法的代表之一。除了Amondys 45之外，还有多款在研和获批疗法旨在恢复抗肌萎缩蛋白的表达水平。下面我们来看一看这些疗法的最新进展。

▲恢复抗肌萎缩蛋白水平的部分疗法（数据来源，公开资料，药明康德内容团队制图，点击可见大图）

外显子跳跃疗法

编码抗肌萎缩蛋白的DMD基因是人体中最大的基因之一，它包含了79个外显子，全长超过约 2.4 Mb。这一基因表达的抗肌萎缩蛋白包含4个主要的蛋白域，在蛋白N端的肌动蛋白结合域（ABD），在蛋白C端的半胱氨酸富集结构域（CR）和C端结构域（CT），以及蛋白中间由24个血影蛋白样重复（spectrin-like repeats）构成的杆状结构域。

在DMD患者中，DMD基因中出现的基因突变，片段丢失或者扩增，导致抗肌萎缩蛋白的合成过早中断，生成的蛋白无法与肌肉细胞中的其他蛋白结合，丧失其正常功能。

▲DMD基因结构（a）以及正常（b）和异常（c）抗肌萎缩蛋白结构（图片来源：参考资料[2]）

外显子跳跃疗法的原理是通过改变表达抗肌萎缩蛋白的mRNA的剪接过程，跳过让蛋白合成过早中断的基因变异，这一策略生成的抗肌萎缩蛋白虽然比正常蛋白要小一些，但是保留了大部分与其他蛋白结合的结构域，因此仍然可以行使蛋白的部分正常功能。

目前，已经有4款反义寡核苷酸疗法获得FDA批准，治疗DMD患者。这些反义寡核苷酸疗法包含一小段核苷酸序列，它们通过与mRNA前体的特定序列结合，改变mRNA的剪接过程。目前的获批疗法靶向外显子51、53、和45。这些区域都是DMD基因变异的多发区域，因此接近有30%的患者适合接受这些疗法的治疗。

图片来源：Sarepta公司官网

外显子跳跃疗法的局限性在于它们只能针对在DMD基因特定区域出现变异的患者。而且，目前获批疗法生成的抗肌萎缩蛋白水平并不是很高，提高外显子跳跃疗法生成的抗肌萎缩蛋白水平是改进这一疗法疗效的关键。

这一领域的研发重心在于如何提高输入到患者体内的寡核苷酸片段的稳定性、安全性以及靶向递送到肌肉的能力。例如，第一三共公司开发的DS-5141b使用了一种不同的化学修饰，来降低寡核苷酸的免疫原性，并增强其稳定性。而Sarepta公司开发的SRP-5051则将反义寡核苷酸偶联在与肌肉细胞表面蛋白结合的多肽链上。这一设计能够让SRP-5051更有效地递送到肌肉细胞中，在提高疗效的同时也有可能降低用药剂量，从而提高了安全性。去年12月发布的2期临床试验结果显示，SRP-5051在用药剂量比获批的Exondys 51低10倍的情况下，反而提高外显子跳跃频率1.6倍，提高抗肌萎缩蛋白表达水平5倍。

▲Sarepta公司提高外显子跳跃疗法效果的多肽偶联策略（图片来源：Sarepta公司官网）

还有的在研疗法通过基因疗法在体内表达反义寡核苷酸，从而提高反义寡核苷酸疗法的持久性。

需要指出的是，目前这些疗法的批准是基于它们提高抗肌萎缩蛋白表达水平的能力。虽然理论上抗肌萎缩蛋白表达水平更高会导致肌肉功能改善，但是这些疗法仍然需要临床试验确认患者在运动能力上的改善。

基因疗法

另一类提高抗肌萎缩蛋白水平的疗法是基因疗法。这种方法将表达抗肌萎缩蛋白的转基因包装在AAV病毒载体中，然后将这些病毒注入患者体内。它们通过转染患者的肌肉细胞，让肌肉生成具有部分抗肌萎缩蛋白功能的重组蛋白。基因疗法的优势在于，它可以对携带任何类型DMD基因变异的患者生效。以AAV病毒作为载体的基因疗法高效转染肌肉组织的能力已经得到了证实。而且，基因疗法理论上可以让患者接受一次治疗之后，获得长期持久的改善，而上面提到的外显子跳跃疗法需要患者长期不断接受治疗。

DMD基因是人类基因组中最大的基因之一，表达抗肌萎缩蛋白的cDNA长度超过11 kb，而AAV载体能够容纳的基因长度只有大约4.7 kb。因此，目前的基因疗法携带的转基因编码称为“微抗肌萎缩蛋白或迷你抗肌萎缩蛋白”的精简版抗肌萎缩蛋白。它们删除了蛋白中间的大量血影蛋白样重复，但是保留了最关键的蛋白结合域。这些蛋白能够弥补全长抗肌萎缩蛋白的部分功能。

▲全长抗肌萎缩蛋白（a）和基因疗法表达的几种微抗肌萎缩蛋白（b）（图片来源：参考资料[6]）

目前，辉瑞公司开发的基因疗法PF-06939926已经完成3期临床试验的首例患者给药。这款基因疗法将由人类肌肉特异性启动子控制的迷你抗肌萎缩蛋白（mini-dystrophin）转基因装在腺相关病毒9（AAV9）载体中。此前的1b期临床试验结果显示，在接受治疗12个月后，患者不但持续表达抗肌萎缩蛋白，而且通过NorthStar门诊评估量表（NSAA）评估的运动功能也得到改善。

Sarepta公司去年也与罗氏（Roche）达成合作，共同开发名为SRP-9001的基因疗法。这一疗法使用的是从非人灵长类动物中分离出的AAVrh74载体，它的优点是能够在肌肉中引起转基因的强力表达，不会穿过血脑屏障进入中枢神经系统。而且，较少患者体内存在针对这一病毒载体的免疫力。今年1月，该公司公布了2期临床试验的初步结果，在接受治疗时4-5岁的受试者中，接受SRP-9001治疗48周之后，评估运动能力的NSAA评分得到改善。

▲SRP-9001显著改善4-5岁受试者的NSAA评分（图片来源：Sarepta公司官网）

基于AAV载体的基因疗法需要面对的一个挑战是很多患者体内已经存在针对AAV病毒载体的中和抗体。这会降低基因疗法的效力。因此，如何在已经产生AAV中和抗体的患者中使用基因疗法是研发人员需要解决的问题。Sarepta公司在这方面已经进行了多种布局，一方面，该公司与Hansa Biopharma公司达成合作，利用该公司的imlifidase抗体裂解酶在使用基因疗法之前，清除针对AAV的IgG抗体；另一方面，该公司也与Codiak BioSciences达成合作，联合开发使用外泌体递送基因疗法的新技术。

无义突变通读（nonsense mutation Readthrough）疗法

在大约13%的DMD患者中，无义突变导致终止密码子的出现，从而导致蛋白合成过程提前终止，生成功能缺失的抗肌萎缩蛋白。

目前，一款名为ataluren的小分子化合物已经获得欧盟有条件批准，商品名为Translarna。它能够通过与终止密码子结合，让负责转译RNA的核糖体在读到终止密码子的地方添加一个氨基酸，而不是停止转译过程。这款药物目前在3期临床试验中接受检验。

除了ataluren以外，庆大霉素（gentamicin）也具有无义突变通读的效力，然而这类疗法除了只能用于携带无义突变的DMD患者以外，很重要的一点是它的安全性。因为终止密码子在蛋白的正常合成方面有重要的作用，因此这些药物存在的毒副作用可能让它们不能长期使用。目前的一个研究方向是筛选安全特征更好的无义突变通读疗法。

DMD的疗法开发是一个与疾病赛跑的过程。近年来，在患者组织和研发和监管机构的合作努力下，DMD疗法的开发步伐不断加速。2016年9月，第一款治疗DMD的外显子跳跃疗法才获得FDA批准，如今已经有4款外显子跳跃疗法获批。我们期待DMD患者们能够迎来更多医疗突破，挽救他们的生命。

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